差示掃描熒光法 （DSF，內在熒光法）是一種經濟高效且易于使用的非標記生物物理技術，其原理是通過測量溫度升高時熒光發(fā)射的相應變化來確定蛋白質的熱變性轉變溫度（所謂的熔解溫度，T_m值）。

新一代高通量差示掃描熒光儀 SUPR-DSF 利用內在熒光 (IF)技術，依賴于色氨酸固有熒光發(fā)射光譜波長的變化。SUPR-DSF 使用行業(yè)標準的 384 微孔板，在幾小時內，而不是幾天和幾周，就可以對數千個樣品的穩(wěn)定性進行測量和比較。SUPR-DSF 結合了低樣品用量和高通量兩個優(yōu)勢，解決了傳統(tǒng)技術所遇到的挑戰(zhàn)。

圖2內在熒光 DSF 原理：依賴于色氨酸固有熒光發(fā)射光譜的變化

在生物藥物早期發(fā)現中可以使用 SUPR-DSF 進行突變體的比較和篩選，本例對 16 個樣品進行比較，其中包括 1 個野生型蛋白（WT）和 15 個單點突變體。

準備終濃度為 0.2 mg/mL的樣品，以每孔 20 μL 的體積將其加入384微孔板，每個樣品做三次重復，在微孔板上放置透光膜以防止蒸發(fā)。微孔板以 1°C/min 的速率進行掃描，掃描溫度范圍為 20°C - 100°C。使用標準方程對數據進行擬合，然后通過熔解溫度 T_m 對穩(wěn)定性進行排序。

SUPR-DSF 生成了16個樣品的高質量熔解曲線，并且，計算出的三次重復數據的熔解溫度差異小于 0.2°C。如圖3所示，與野生型WT（藍色）相比，其中3個突變體（9、13和14）的熔解曲線左移，說明其蛋白穩(wěn)定性降低；其余12個突變體的穩(wěn)定性均有所提高，突變體1、8和12的穩(wěn)定性提高最大。

圖3 15個突變體（橙色）與野生型（藍色）的熔解曲線對比

圖4展示了幾個代表性樣品的熔解曲線，可以發(fā)現一些蛋白質發(fā)生了單一熱轉變（WT蛋白與突變體7和8），而另一些蛋白質（突變體1和14）則清楚地顯示出兩次熱轉變，熔解曲線上有兩個拐點。此外，包括突變體1在內的幾個突變體在第一次熱轉變時具有與突變體8非常相似的熔解曲線，但隨后在更高的溫度下進行了第二次熱轉變。

突變蛋白質從單一熱轉變到兩次熱轉變的變性能力表明，進一步的修飾應該關注于蛋白質中較不穩(wěn)定的區(qū)域。通過 SUPR-DSF 提供的數據，可以幫助研究者篩選出有前景的候選物進行深入研究。

圖4 代表性樣品的熔解曲線

上述實驗中SUPR-DSF在1.5小時內產生了48個樣品（16個突變體，3次重復）的高質量熔解曲線，但很容易擴展到384個樣品（一塊384孔板），在同樣的掃描條件下完成384個樣品的測試也僅需1.5小時。

結論 Conclusion

通過上述實驗可以看出SUPR-DSF與目前穩(wěn)定性研究的其他技術相比，具有非常顯著的高通量優(yōu)勢。SUPR-DSF不僅記錄了熔解溫度 T_m，還可以給出：去折疊的起始溫度 T_onset和范特霍夫焓變ΔH_vH，從而更深入地了解樣品之間的差異。

綜上所述，新一代 SUPR-DSF具有高靈敏度、高通量和耗材通用性好等優(yōu)勢，使用10-20 μL樣品在90分鐘內即可給出384個樣品的T_m、T_onset和ΔH_vH等信息，確定不同樣品之間的微小差異，避免候選藥物的下游失敗，從而大大節(jié)省了生物治療藥物發(fā)現過程中的時間和成本。